诺如病毒临床特点及实验室诊断

   1．临床特征

　　感染后潜伏期多在24～48h，少数在18～72h。发病突然，主要症状为恶心、呕吐、腹痛和腹泻。儿童患者呕吐普遍，成人患者腹泻为多，24h内腹泻4～8次，粪便为稀水便或水样便，无粘液脓血，粪检白细胞阴性。原发感染患者的呕吐症状明显多于续发感染者，有些病人仅表现出呕吐症状，故在临床曾有冬季呕吐病诊断。此外，头痛、轻度发热、寒颤和肌肉痛也是常见症状，严重者出现脱水。

　　2．临床诊断

　　20年前，曾制定了NLV流行的临床和流行病学诊断标准：粪便细菌和寄生虫检测阴性；呕吐患者占病人半数以上；病程在12～60h；潜伏期在24～48h，近来又将潜伏期修改为12～36h，并补充发病急、恶心、呕吐、腹泻、胃痛和少数病人发热、发冷等临床现象。

　　3. 实验室诊断

　　3.1标本采集

　　粪便标本应在发病首日采集，至多不能超过发病急性期(48～72h)，此时为稀、软便，病毒排出量最多。一次流行，至少采集10例患者粪便，每份标本量约1～5ml，成形便和肛拭子诊断意义很小。标本置4℃可存放2～3周，运送也要低温条件。病人呕吐物是粪便标本的最佳补充，有助于病原的诊断。该标本的采集、储存和运送条件同于粪便。从流行病学角度出发，在水、食物或其它外环境标本中检出NV意义重要。需注意检测技术要锁定在高度怀疑的传播媒介上，尽早采样并置4℃存放，若是饮用水，需用大容量(5～100L)浓集病毒后检测。

　　3.2实验室检查

　　3.2.1电镜法 直接电镜法(EM)和免疫电镜法(IEM)，EM 法观察的灵敏度较低，要求每毫升粪便样品中至少有大约 106个病毒粒子，因此只能用于患病早期病毒大量排出时采集的样本检测。IEM 法比 EM 法的敏感性可提高 100 倍，主要应用患者恢复期血清捕捉同型抗原，从而增加检出率。电镜法的缺陷在于设备昂贵，不能广泛普及；检测结果与操作者的技能和经验有直接关系；灵敏度相对较低；不适于大规模流行病学调查。

　　3.2.2免疫法 包括放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy)和酶联免疫法(ELISA)。RIA法的灵敏度比IEM 法可 提高10～100倍，可以检测出抗体升高的水平，为流行病学提供更有参考价值的资料。RIA 法的不足之处在于它需要 6 d，且需要放射性同位素标记。为了简化方法，美国疾病预防控制中心建立了生物素-亲和素免疫法，其灵敏度与 RIA 法相当，目前该方法已成为美国疾病预防控制中心检测NLV抗原和抗体的标准实验方法之一。1992年Jiang 等重组杆状病毒表达NV衣壳蛋白成功后，建立起的 NV 酶联免疫检测方法快速、灵敏、经济，其不足之处是免疫反应的株型特异性太强，所以应用范围还比较窄。酶链免疫法特异性强，灵敏度高，诊断迅速，且较经济，是目前可广泛应用的检测方法。由于NLV培养还未成功，原来用作试剂的病毒抗原数量受到限制，现在，用分子生物学技术已经可以人工重组NV的衣壳蛋白，从而解决了上述问题。

　　3.2.3分子生物学检测方法

　　杂交技术和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)除了能更准确、灵敏地检测标本中的NV，尤其是低浓度的NV感染外，最大的优点在于可以进一步对病毒进行基因型的研究，不会受到获得分型单克隆抗体的限制，对流行病学研究具有重要意义。

　　等温核酸扩增法 (NASBA)直接扩增RNA 来检测 NV，样品中病原RNA得到指数级扩增，产物通过琼脂糖凝胶电泳或斑点印迹杂交鉴定结果。该方法的灵敏度略低于 RT-PCR 法；整个过程只有一步RNA扩增，避免了RT-PCR存在的RNA交叉污染；缩短了操作时间；假阳性率低。

　　4.食物中NV的检测

　　RT-PCR检测食物中NV存在样品病毒量含量低，样品量大且成分复杂等问题，因此病毒富集浓缩、样品处理是检测的关键，其中有两个重要方面影响检测结果，一是样品中病毒浓缩后的回收率，二是抽提核酸的完整程度和纯度。

　　4.1病毒浓缩

　　NV 浓缩方法一般分为两大类，一类为有机絮凝沉淀法，主要使用聚乙二醇（PEG）沉淀，PEG 是具有强烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物，先改变样品 pH 值，使毒粒与样品微粒分开，PEG 把病毒沉淀下来，达到浓缩的目的。目前对于固体样品 PEG 沉淀法是最有效的浓缩方法。

　　膜过滤法是另一类有效浓缩病毒的方法，通过改变膜的pH值使之与带有电荷的毒粒结合捕捉病毒，这种方法通常用在浓缩大体积的黏度小、内容颗粒小的液体食品或水中。检测海水、生活污水中的NV曾用过这种方法，为瓶装水和其他饮料浓缩NV提供了参考。

　　4.2核酸提取

　　食品样品成分复杂，所含有的脂肪、蛋白质、金属离子等物质都是 RT-PCR 反应抑制因子。NV是单链RNA病毒，核酸提取方法的优劣取决于两个方面：核酸的质量和去除抑制因子的能力。目前应用较成熟广泛的是胍法 RNA 提取法，即（异）硫氰酸胍-苯酚-氯仿联合裂解抽提法，该方法改进后制成市售的TRIzol、RNAzol、Ultraspec 等产品，与石英砂、磁珠等多孔颗粒相结合，已结合了poly(dT) 或特异探针的磁珠能较高程度的提纯mRNA，去除反应抑制因子。石英砂或磁珠纯化 RNA与传统的有机试剂（异丙醇、乙醇）沉淀 RNA 相比起来，效果较好，只是成本偏高。

　　5.NV腹泻治疗

　　该病为自限性疾病，通常患者病程在48～72h，有的则更短。目前尚无特效的抗病毒药物，不需用抗菌素，预后良好。治疗主要是对症治疗或支持疗法。脱水是NLV腹泻致死的主要死因，故对严重病例，尤其是幼儿及体弱者应及时输液、纠正水、电解质、酸碱平衡失调，或口服世界卫生组织推荐的口服补液盐。